SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE

Bioluminescence et énergie cellulaire

Didier Palissiere — 2013-06-04T10:36:00Z

Expérience : bioluminescence et énergie cellulaire :

cette expérience est directement tirée du site de Didier pol.
Pour toute la partie théorique, je vous invite à aller directement sur le site de Didier Pol
http://www.didier-pol.net/3ATP&BL.html#Energ%E9tique
Vous y trouverez la théorie nécessaire à la compréhension du phénomène étudié avec un récapitulatif des réactions chimiques responsables de la luminescence chez la luciole.

La première étape va consister à réaliser une courbe étalon IL(%)=f([C] ATP)
Cette étape est faite au laboratoire. Les produits sont couteux, l'élaboration de la courbe étalon par les élèves n'a que peu d'intérêt ici.
La deuxième étape consistera à mesurer la quantité d'ATP dans une solution de levure. (après l'avoir isolé)
Tout ce qui suit est directement inspiré de la partie II « bioluminescence et enzymologie, puis bioluminescence et énergie cellulaire ».La réalisation pratique suit le protocole indiqué.
Le kit utilisé est produit par la société sigma-Aldrich.
kit bioluminescence
référence : FLAA-1KT
prix : 338,5 €
ce kit contient le complexe luciférine-luciférase, l'ATP lyophylisé, la solution tampon.
produits séparés :
complexe luciférine-luciférase :
référence : FLE 250-1VL
prix : 68 €
attention nous avons utilisé le FLE 50 ( quantité plus petite donc moins chère. malheureusement Sigma a décidé de ne plus commercialiser cette référence)
ATP 1 mg
référence : FLAAS-1V
prix : 44,3€

les résultats obtenus
Mise en évidence de l'ATP par bioluminescence ( suite) :
Il faut d'abord préciser que cette expérience est censée se faire avec un luminomètre. Le luminomètre effectue des mesures d'intensité lumineuse. Dans mon cas, j'utilise un spectrophotomètre du type spectrovis ( il est référencé dans un article précédent intitulé : les nouveautés en exao pour l'étude des métabolismes). Nous travaillons donc sur des absorbances.
La première chose à effectuer est de regarder à quelle longueur d'onde absorbe notre mélange luciférine-luciférase. J'ai constaté une absorbtion maximale à λ= 407 nm
J'ai donc travaillé à cette longueur d'onde.
J'ai préparé comme indiqué le mélange luciférine-luciférase, puis j'ai fait ma solution ATP-MgSO4.
J'ai effectué ensuite les dilutions de la solution mère d'ATP, car comme le précise didier Pol, lorsque l'on effectue les mesures de cinétique, on se rend compte que pour obtenir une courbe étalon linéaire, il faut s'intéresser aux valeurs les moins concentrées d' ATP ( à savoir 0 à 150 µg d'ATP)
J'ai donc réalisé des solutions à
12,5 µg ; 25µg ;50µg ;100µg ;150µg d' ATP.
J'ai étalonné mon spectrophotomètre, puis, j'ai mis mon complexe luciférine luciférase dans une cuve de mesure. Je lance la mesure, et, ensuite j'injecte ma solution d'ATP en commençant par la solution la moins concentrée.
J'ai recommencé cette opération avec chacune de mes solutions d'ATP.

matériel utilisé avec le logiciel logger pro
Intérêt : ce logiciel est compatible mac PC.

Exemples de résultats obtenus avec le spectrophotomètre

J'ai pris les valeurs d'absorbances à t= 2s, puis d'après les indications du site de Didier Pol, j'ai fait une approximation entre les absorbances obtenues et le pourcentage d'intensité lumineuse.
l'absorbance de la solution d'ATP à 150 µg étant estimée correspondre à une valeur de 30% en IL.
Ces résultats permettent d'effectuer une courbe étalon mettant en relation la concentration en ATP avec l'intensité lumineuse. IL = f [ ATP ]. On peut à la suite de cela, faire des estimations de concentration en ATP sur, par exemple, des solutions de levures .

La courbe étalon obtenue :

Il faut ensuite réaliser une solution de levure à concentration connue. Il faut ensuite déterminer la concentration cellulaire de notre solution. J'ai réalisé une solution à 1gL-1, ce qui est déjà limite pour effectuer un comptage.

Je ne reviens pas sur le comptage sur lame kova. Le descriptif du comptage est donné avec les lames.
on compte ici entre 240 & 260 cellules par case.
Ceci correspond à peu près à 22 millions de cellules par ml de solution.
Détermination de la concentration en ATP dans une solution de levure

La mesure d'absorbance de la solution de levure mise en présence du complexe luciférine-luciférase nous donne une valeur d'absorbance de abs= 0,753
si l'on se réfère à la gamme étalon, on obtient une valeur approximative de 12,32 % d'intensité lumineuse. Nous avons donc une concentration d' ATP qui se situe ente 12,5 & 50 µg.
Si l'on se rapporte à la concentration cellulaire :
Partons d'une moyenne entre 12,5 et 50
soit approximativement 31
31/ 22000000 = 14,2 10- 7 µg d'ATP soit environ 14,2 10-13 g d'ATP par cellule.
22 millions étant le nombre de cellules par ml.

Dans la dernière expérience, de l'eau a été injectée dans le complexe luciférine-luciférase pour servir de témoin.

Le spectre d'absorption des pigments photosynthétiques.

Didier Palissiere — 2012-12-17T19:25:00Z

Les pigments de la chlorophylle

J'ai relevé une activité intéressante dans le livre Belin de spé ancien programme, et je l'ai reproduite.
L'activité est simple, il s'agit de réaliser dans un premier temps une chromatographie sur whatman.

d'après SNV JUSSIEU.
Il s'agit là d'utiliser un protocole classique ( solvant :ether de pétrole, propanone)
écrasement de la feuille d'épinard sur le papier whatman à l'aide d'un agitateur en verre.(temps de migration :30 minutes environs sans déplacer la colonne).
IL faut ensuite utiliser un spectrophotomètre relié en USB au PC.
Faire une solution de chlorophylle brute :
trois feuilles d'épinard découpées sans la nervure centrale dans un mortier, un peu de sable de fontainebleau, 20 ml d'éthanol à 95°. Broyer fermement et assez longtemps. ( 5 min )Filtrer.Vous avez une solution de chlorophylle brute.
Lorsque vous la passez dans le spectro, elle peut apparaitre comme trop concentrée. ( saturation au niveau de l'absorption ) Il suffit de la diluer ( toujours avec de l'éthanol).
Il faut maintenant utiliser les résultats des chromatographies sur papier whatman des élèves.
exemple de résultat :

Il suffit maintenant de découper les chromatographies, afin de séparer les pigments. Ensuite, on fait infuser les différents pigments dans des cuves spécifiques.

Il ne reste plus désormais qu'à passer les différentes cuves dans le spectrophotomètre.
exemple de résultat obtenu :

Une erreur à éviter :
Sur mon spectre,la chlorophylle b absorbe également dans les mêmes longueurs d'ondes que la chlorophylle a. Je pense qu'en fait, il devait rester dans la partie du whatman que j'ai découpé un peu de chlorphylle a. Ceci expliquerait le spectre trop large de
la chlorophylle b.

la fermentation lactique

Didier Palissiere — 2012-10-25T11:44:00Z

La fermentation

La fermentation lactique :

Lorsque l'on aborde la fermentation, on étudie la plupart du temps la fermentation alcoolique. ( cf par exemple sujet ECE 2011 MALTOSE ET METABOLISME DES LEVURES ).

Il peut donc être intéressant de changer de fermentation et partir sur un TP fermentation lactique qui réclamera aux élèves d'utiliser l'exao, mais également le microscope.

Ce TP leur permettra également de réaliser des frottis bactériens pour observer l'évolution des populations et pouvoir faire une corrélation entre l'évolution bactérienne et l'évolution du pH.

PRECISION : le thème N°1 exclue les procaryotes.... mais on est malgré tout dans le cadre d'une fermentation.

Aspect du montage :

matériel utilisé :

Interface portable labquest (vernier) et une sonde pH. (société Calibration)

Bain marie (société Jeulin)

ferment lactique (société Jeulin)

On peut travailler par exemple sur un premier mélange dit traditionnel :

composition : 25 % lactobacillus bulgaricus/75 % streptococcus thermophillus

ce mélange doit nous amener à un yaourt assez acide et de texture plutôt cassante.

résultat exao :

On peut noter sur le côté une photo prise au microscope.
On peut en effet observer l'évolution des populations bactériennes ( LACTOBACILLUS vulgaris, STREPTOCOCCUS thermophillus )
en faisant varier la température en fonction des paillasses élèves. Ils peuvent ainsi voir une correspondance entre texture, acidité, et population bactérienne.

Les nouveautés en exao pour l'étude des métabolismes.

Didier Palissiere — 2012-10-14T15:06:00Z

La société Jeulin propose maintenant depuis quelques années les produits suivants :

La pince à photosynthèse a l'avantage de pouvoir réaliser des expériences de photosynthèse sans abîmer la plante. On peut également mettre un cache pour faire l'obscurité.
Les enceintes cellulaires :
vous les trouverez sous des noms divers "cytoréacteur" "bioréacteur", leurs fonctions restent les mêmes : la mise en évidence de métabolismes respiratoire, fermentaire ou photosynthétique.
Les divers fournisseurs ont développés des solutions plus économiques qui méritent d'être citées.
voici quelques modèles tirés des catalogues jeulin, eurosmart, et sordalab :

Ces enceintes ont désormais l'avantage d'être dissociées de leur module d'agitation. Le cout global enceinte et agitateur magnétique reste inférieur au prix des anciennes enceintes complètes.
De plus, les agitateurs magnétiques sont utilisables sur d'autres manipulations.

Les sources de lumières ont également progressé .
Les sources de lumière froide sont des matériels trop onéreux pour nos laboratoires, les lampes à LED peuvent être une solution de remplacement.
En voici quelques exemples :

Le dernier modèle présenté vient de la société micrelec.
Il vaut la peine de s'intéresser à lui, car il ne s'agit pas d'une simple source lumineuse. C'est également un agitateur magnétique. L'intensité lumineuse peut être réglée. On peut également travailler à des longueurs d'ondes définies.
La société sordalab, propose pour sa part une ampoule à mettre sur une simple lampe de dissection ( 40w double isolation)

Les élèves sont très friands de ce type de matériel sur la paillasse.
L'expérience n'en prend que plus d'intérêt à leurs yeux, leur application à bien faire aussi.
D'autres dispositifs qui jusqu'à maintenant étaient peu ou pas utilisés, sont les colorimètres et spectrophotomètres. Leur prix,bien qu'encore élevé, les a rendu un peu plus abordable. De plus en plus de manipulation de cinétique enzymatique sont proposées avec eux.
Je vous présente donc un colorimètre et un spectrophotomètre proposé par la société vernier qui fonctionnent très bien. Il faut cependant noter que la mise en oeuvre par les élèves et parfois délicate. Avec de la persévérance on y parvient malgré tout.

Le colorimètre permettra de fonctionner à des longueurs d'ondes définies, le spectrophotomètre permet de travailler de travailler à des longueurs d'ondes variables ou définies. ( Il peut donc être utilisé en colorimètre)
La définition du spectrophotomètre est beaucoup plus fine, mais pour les expériences que nous réalisons en cinétique enzymatique, les colorimètres suffisent amplement.
Le spectrophotomètre sera utilisé pour visualiser par exemple le spectre d'absorption de la photosynthèse. Il permettra même de pouvoir distinguer de façon spécifique les longueurs d'ondes de chaque pigment.
Dans un prochain article, nous aborderons à proprement parler les manipulations que l'on peut réaliser avec ces divers matériels.

Les consoles et interfaces pour faire de l'EXAO.

Didier Palissiere — 2012-10-09T22:00:32Z

Avant d'aborder dans de prochains articles des manipulations axées sur le nouveau programme de TS spécialité, j'aimerais aborder un domaine qui peut être touché à plusieurs reprises : celui de l'exao.
En effet, ces dernières années, les fournisseurs pédagogiques, grâce aux évolutions techniques du matériel informatique ont fait évoluer leurs matériels.
Je voudrais donc mettre l'accent sur les matériels nomades et autonomes.
Mon expérience me montre que la chaine d'acquisition classique est parfois bien lourde à mettre en oeuvre.
Il devient rare d'avoir une salle totalement dédiée à l'exao. De plus en plus, nous travaillons sur des ordinateurs portables, car ils apportent une plus grande flexibilité de fonctionnement ( logiciel de simulation, exao, tableur, traitement de texte ). La chaine d'acquisition classique
capteur + adaptateur + interface + ordinateur + bioréacteur
est assez indigeste.
Il faut également parler des alimentations diverses qui peuvent être associées, ainsi que des fils.
Une interface portable dotée d'un écran tactile couleur peut résoudre le problème.
La chaine d'acquisition se trouve singulièrement réduite
capteur + interface ( autonome en électricité )
L'élève a de nouveau de la place pour travailler à côté de la manipulation. De plus les interfaces nomades résistent mieux aux projections d'eau que les ordinateurs.
Les principales entreprises ayant développé du matériel exao en france sont au nombre de cinq :

trois françaises : MICRELEC, JEULIN, EUROSMART

deux américaines : PASCO, VERNIER

Il faut savoir pour l'anecdote, que la loi française autorise les fournisseurs américains à pouvoir s'implanter sur notre territoire, l'inverse n'est malheureusement pas vrai.

1) MICRELEC
Cette société propose depuis peu son interface "orphylab" connectée avec une tablette PC.
Elle dispose d'un site internet que je vous conseille d'aller visiter pour plus d'information sur le matériel.

Une connexion wifi s'établit entre la tablette et l'interface.
l'échantillonnage va de 200 à 500 khz, l'interface est dotée d'USB d'une sortie DB9 ( pour les acquisitions vidéo rapides), connectivité bluetooth.
L'autonomie annoncée est de deux heures.
Le gain de place sur la paillasse est évident. Après, on manque de recul sur la durée de vie des tablettes et leur résistance face à un élève.
Pour le coût il faut l'estimer environ à 1000 € ( hors capteur, hors logiciel)

2)JEULIN
C'est l'entreprise qui propose le plus de nouvelles solutions en la matière.

Console SYNEO

Les capteurs se connectent sur la partie supérieure de l'interface. Elle est dotée d'un écran tactile couleur de 17,8 cm de diagonale.Elle est dispose de ports USB pour clavier et souris.L'écran tactile se contrôle avec un stylet.
L'échantillonnage est de 100 khz. L'autononmie annoncée est de deux heures. Le prix est un peu inférieur à 1000 € pour l'interface seule
De nombreux didacticiels et "pdf" sont disponibles sur le site de l'entreprise pour vous donner une idée plus précise sur le matériel.

Console FOXY

Cette console, au premier abord, semble identique à une console classique. Elle est cependant totalement autonome. Le logiciel d'acquisition est intégré. On peut donc travailler sans l'ordinateur.Elle ne dispose d'aucun écran. Cependant les boitiers des capteurs sont pourvus d'un petit écran digital qui permet de lire des valeurs instantanées. Il semblerait que de nombreux enseignants aient fait remonter à la société un désir de pouvoir faire travailler les élèves de façon plus "cérébrale" sur l'élaboration de leurs graphiques. Ainsi, ils seraient obligés de réfléchir sur les notions d'échelle et réapprendraient à construire une courbe. Heureusement, l'interface peut tout de même être connectée à un ordinateur (via USB), c'est même indispensable pour les mises à jour du logiciel interne.
Enfin, si l'on veut travailler un petit peu son compte rendu d'expérience, il vous faudra vous doter de l'atelier scientifique. Vous avez également la possibilité de visualier vos résultats sur tablette (ipad) grâce à l'application (gratuite !) padlab

taux d'échantillonnage de 15Mhz. coût de la console légèrement inférieur à 1000 euros.
Là encore, le site de l'entreprise est très fourni en "pdf" pour plus de précision (rubrique exao, console)

Console Airnext

Cette console entièrement autonome sera commercialisée en novembre 2012. Elle est utilisable seule ou connectée à un PC.Son originalité réside dans le fait qu'elle fonctionne avec des "pods"

Les pods servent en fait à recevoir les capteurs ( sondes diverses ), ils dialoguent par wifi avec la console. Les seuls fils sont donc ceux qui relient le capteur et son adaptateur. Les adaptateurs sont les mêmes que ce soit la console "foxy" ou la console "airnext"
Le coût est environ de 500 € pour la console et le pod .
La résolution du pod est de 100khz.
Le pod dispose d'un mode "automate" qui permet de faire des mesures sur plusieurs jours.
Des exemples d'expériences sont sur le site.
La matériel jeulin est garantie deux ans

3) EUROSMART :
Cette société a la bonne idée de proposer une interface "light" pour les SVT. C'est une déclinaison de la SYSAM SP5 qui est très orientée physique. Les taux d'échantillonnage en SVT sont beaucoup moins exigeant ( 100 khz va déjà au delà de ce que l'on fait même en neuro physiologie ou en electromyographie)
Ainsi, les SYSAM V6 et SYSAM V6B sont nées. Cette interface alimentée par une simple prise USB est commercialisée elle aussi avec une tablette PC sous windows CE ( windows mobile )
Il faut donc ensuite l'équiper du logiciel latis bio pour pouvoir expérimenter.

les deux versions de la SYSAM V6.

La V6 B est encore un peu simplifiée par l'abandon des entrée analogiques périphériques. Il reste les entrées synchro pour faire un déclenchement par le biais d'un marteau réflexe. Cette interface est également dotée d'un GBF interne permettant de produire un signal carré (utile en neurophysiologie dans l'étude du potentiel global d'un nerf)

la tablette samsung commercialisée ( galaxy tab ) avec l'interface

Le coût global estimé est d'environ 1000 € pour l'interface et la tablette (hors capteur et logiciel )
Remarque importante : eurosmart garantie son matériel 6 ans.

4) SORDALAB
Cette société commercialise un matériel exao américain de marque PASCO
La première interface proposée est la GLX

Cette interface monochrome permet de travailler de façon autonome ou bien connecté avec un ordinateur via USB. Il est néanmoins possible d'y connecter une souris et un clavier, voir une imprimante pour faciliter le travail.
Elle dispose d'une mémoire interne de 10 Mo, elle est vendue nativement avec un capteur de température et un capteur de tension.
Le logiciel intégré permet de récolter des données, mais il faut bien reconnaitre que pour une exploitation plus fine, il est recommandé de passer sur un ordinateur doté du logiciel DATASTUDIO
Le coût est actuellement d'environ 500 à 600€.
Mais depuis peu, Pasco fournit une nouvelle interface qui permet véritablement de se dédouaner de l'ordinateur, l'interface SPARK.

Dotée d'un grand écran (diagonale de 15 cm) elle est conçue de façon robuste et ergonomique grâce à ses poignées.
L'écran tactile permet une utilisation sans stylet.
Le logiciel interne est sous linux. Cette interface intègre des expériences "prêtes à l'emploi" ( ce qui correspond en fait à des petits logiciels dédiés ).Le fournisseur reste très vague sur les caractéristiques techniques ( taux d'échantillonnage par exemple )
La capacité en mémoire est de 1go.
Le site de la société est très fourni en documentation sur les expériences réalisables. Le coût est actuellement pour cette interface d'environ 600 à 700 €

5) VERNIER
La société Vernier est également américaine, deux sociétés commercialisent ses produits en france :Calibration qui fut l'entreprise pionnière pour son implantation, Biolab, depuis deux ans est également sur les rangs.
Cette société dispose d'une interface portable très aboutie : le LABQUEST2

La diagonale de l'écran est de 13,2 cm pour une diagonale totale de 15,2 cm. L'écran peut être visionné en format paysage ou portrait. Le contraste a été étudié pour permettre une bonne visibilité en extérieur.
Elle est dotée d'un écran tactile contrôlable au doigt ou au stylet. La résolution est de 12 bits et le taux d'échantillonnage est de 100 khz.Le processeur du labquest2 est deux fois plus rapide que celui du labquest.
Cette console est également dotée d'un accéléromètre ( c'est lui notamment qui permet la rotation d'écran, mais aussi l'expérimentation en sismologie ), d'un GPS, d'un capteur de température, d'un microphone.
Elle est équipée du logiciel loggerlite qui est la version mobile du logiciel loggerpro fourni avec les interfaces classiques. Elle dispose également de la connectivité wifi b/g/n et d'une interface bluetooth.
Elle dispose de trois ports pour les capteurs, de port USB, mini USB et d'un slot microSD pour augmenter la mémoire interne de 200 Mo.
Elle dispose également dans le logiciel d'outils d'analyse ( statistique, intégration, tangente). La gestion de l'écran est très proche de la gestion sur ordinateur.

Elle est enfin équipée d'une batterie haute capacité qui vous permet d'envisager une expérimentation à la journée.
Son coût actuel est estimé entre 550 et 600€. Le matériel vernier est garanti 5 ans.

Pour conclure, si j'attire votre attention sur ses consoles de nouvelles générations, c'est que mon expérience me montre que ce format attire les élèves. Proche de leur téléphone et de leur fonctionnement, ils se repèrent très vites dans ce type d'environnement. Leur intérêt pour la manipulation en est décuplé. Vous gagnez de la place sur la paillasse pendant la manipulation. Le matériel peut être intégralement rangé en fin d'expérience. ( vous évitez donc toutes dégradations éventuelles ) Enfin, utiliser ces interfaces libèrent également les ordinateurs pour une autre classe.
Dans un prochain article, j'aborderai les capteurs et matériels novateurs pour l'expérimentation proprement dite.

Introduction aux ressources techniques

Didier Palissiere — 2012-10-09T22:00:00Z

Les quelques articles qui vont suivre n'ont pour but que de proposer et non d'imposer des matériels, des manipulations qui, sans forcément être novateurs, nous sont apparus comme intéressants pour aborder cette partie du programme (le thème N°1). Des fournisseurs de matériel pédagogique seront cités dans les articles suivants car ils ont attiré notre attention. Cela ne veut pas dire pour autant qu'il n'existe pas, chez d'autres fournisseurs, des matériels tout aussi intéressants, voire novateurs. Simplement, il nous semble impossible de les citer tous.
dans un premier temps voici un rappel du bulletin officiel donnant le cadre de notre travail :