Expérience : bioluminescence et énergie cellulaire :

cette expérience est directement tirée du site de Didier pol.
Pour toute la partie théorique, je vous invite à aller directement sur le site de Didier Pol
http://www.didier-pol.net/3ATP&BL.html#Energ%E9tique
Vous y trouverez la théorie nécessaire à la compréhension du phénomène étudié avec un récapitulatif des réactions chimiques responsables de la luminescence chez la luciole.

La première étape va consister à réaliser une courbe étalon IL(%)=f([C] ATP)
Cette étape est faite au laboratoire. Les produits sont couteux, l’élaboration de la courbe étalon par les élèves n’a que peu d’intérêt ici.
La deuxième étape consistera à mesurer la quantité d’ATP dans une solution de levure. (après l’avoir isolé)
Tout ce qui suit est directement inspiré de la partie II « bioluminescence et enzymologie, puis bioluminescence et énergie cellulaire ».La réalisation pratique suit le protocole indiqué.
Le kit utilisé est produit par la société sigma-Aldrich.
kit bioluminescence
référence : FLAA-1KT
prix : 338,5 €
ce kit contient le complexe luciférine-luciférase, l’ATP lyophylisé, la solution tampon.
produits séparés :
complexe luciférine-luciférase :
référence : FLE 250-1VL
prix : 68 €
attention nous avons utilisé le FLE 50 ( quantité plus petite donc moins chère. malheureusement Sigma a décidé de ne plus commercialiser cette référence)
ATP 1 mg
référence : FLAAS-1V
prix : 44,3€

les résultats obtenus
Mise en évidence de l’ATP par bioluminescence ( suite) :
Il faut d’abord préciser que cette expérience est censée se faire avec un luminomètre. Le luminomètre effectue des mesures d’intensité lumineuse. Dans mon cas, j’utilise un spectrophotomètre du type spectrovis ( il est référencé dans un article précédent intitulé : les nouveautés en exao pour l’étude des métabolismes). Nous travaillons donc sur des absorbances.
La première chose à effectuer est de regarder à quelle longueur d’onde absorbe notre mélange luciférine-luciférase. J’ai constaté une absorbtion maximale à λ= 407 nm
J’ai donc travaillé à cette longueur d’onde.
J’ai préparé comme indiqué le mélange luciférine-luciférase, puis j’ai fait ma solution ATP-MgSO4.
J’ai effectué ensuite les dilutions de la solution mère d’ATP, car comme le précise didier Pol, lorsque l’on effectue les mesures de cinétique, on se rend compte que pour obtenir une courbe étalon linéaire, il faut s’intéresser aux valeurs les moins concentrées d’ ATP ( à savoir 0 à 150 µg d’ATP)
J’ai donc réalisé des solutions à
12,5 µg ; 25µg ;50µg ;100µg ;150µg d’ ATP.
J’ai étalonné mon spectrophotomètre, puis, j’ai mis mon complexe luciférine luciférase dans une cuve de mesure. Je lance la mesure, et, ensuite j’injecte ma solution d’ATP en commençant par la solution la moins concentrée.
J’ai recommencé cette opération avec chacune de mes solutions d’ATP.

matériel utilisé avec le logiciel logger pro
Intérêt : ce logiciel est compatible mac PC.

Exemples de résultats obtenus avec le spectrophotomètre

J’ai pris les valeurs d’absorbances à t= 2s, puis d’après les indications du site de Didier Pol, j’ai fait une approximation entre les absorbances obtenues et le pourcentage d’intensité lumineuse.
l’absorbance de la solution d’ATP à 150 µg étant estimée correspondre à une valeur de 30% en IL.
Ces résultats permettent d’effectuer une courbe étalon mettant en relation la concentration en ATP avec l’intensité lumineuse. IL = f [ ATP ]. On peut à la suite de cela, faire des estimations de concentration en ATP sur, par exemple, des solutions de levures .

La courbe étalon obtenue :

Il faut ensuite réaliser une solution de levure à concentration connue. Il faut ensuite déterminer la concentration cellulaire de notre solution. J’ai réalisé une solution à 1gL-1, ce qui est déjà limite pour effectuer un comptage.

Je ne reviens pas sur le comptage sur lame kova. Le descriptif du comptage est donné avec les lames.
on compte ici entre 240 & 260 cellules par case.
Ceci correspond à peu près à 22 millions de cellules par ml de solution.
Détermination de la concentration en ATP dans une solution de levure

La mesure d’absorbance de la solution de levure mise en présence du complexe luciférine-luciférase nous donne une valeur d’absorbance de abs= 0,753
si l’on se réfère à la gamme étalon, on obtient une valeur approximative de 12,32 % d’intensité lumineuse. Nous avons donc une concentration d’ ATP qui se situe ente 12,5 & 50 µg.
Si l’on se rapporte à la concentration cellulaire :
Partons d’une moyenne entre 12,5 et 50
soit approximativement 31
31/ 22000000 = 14,2 10- 7 µg d’ATP soit environ 14,2 10-13 g d’ATP par cellule.
22 millions étant le nombre de cellules par ml.

Dans la dernière expérience, de l’eau a été injectée dans le complexe luciférine-luciférase pour servir de témoin.